La dynamique des fluides modifie la longueur du corps de Caenorhabditis elegans via le TGF

npj Microgravité volume 2, Numéro d'article : 16006 (2016) Citer cet article

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La fonte des muscles squelettiques est un obstacle majeur à l'exploration spatiale à long terme. Semblable aux astronautes, le nématode Caenorhabditis elegans présente des effets musculaires et physiques négatifs lorsqu'il est en microgravité dans l'espace. On ne sait toujours pas quelles molécules de signalisation et quels comportements provoquent ces altérations négatives. Ici, nous avons étudié les molécules de signalisation clés impliquées dans les altérations du physique de C. elegans en réponse à la dynamique des fluides dans des expériences au sol. Placer des vers dans l'espace sur un accélérateur 1G a augmenté l'expression génique d'une chaîne lourde de myosine, myo-3, et d'un facteur de croissance transformant-β (TGF-β), dbl-1. Ces changements se produisaient également lorsque les paramètres de dynamique des fluides viscosité/résistance à la traînée ou profondeur de culture liquide étaient augmentés au sol. En outre, la longueur du corps a augmenté chez les mutants de collagène de cuticule de type sauvage et de paroi corporelle, rol-6 et dpy-5, cultivés en culture liquide. En revanche, la longueur du corps n'a pas augmenté chez les mutants TGF-β, dbl-1 ou de la voie de signalisation en aval, sma-4 / Smad. De même, un récepteur de la dopamine de type D1, DOP-4, et un canal mécano-sensoriel, UNC-8, étaient nécessaires pour une expression accrue de dbl-1 et un physique altéré en culture liquide. Comme les taux de contraction de C. elegans sont beaucoup plus élevés en nageant dans un liquide qu'en rampant sur une surface de gélose, nous avons également examiné la relation entre l'amélioration de la longueur du corps et le taux de contraction. Les mutants avec des taux de contraction significativement réduits étaient généralement plus petits. Cependant, chez les mutants dop-4, dbl-1 et sma-4, les taux de contraction ont encore augmenté dans le liquide. Ces résultats suggèrent que la signalisation neuromusculaire via TGF-β/DBL-1 agit pour modifier le physique du corps en réponse aux conditions environnementales, y compris la dynamique des fluides.

Le physique d'un individu est façonné sur de longues périodes par des stimuli externes et des allures locomotrices. La fonte osseuse et musculaire sont des adaptations physiopathologiques inévitables en microgravité, par exemple, les vols spatiaux, et avec l'inactivité, par exemple, dans le lit.1–4 La fonte de ces tissus est un obstacle majeur à l'exploration spatiale à long terme. La microgravité, en particulier, diminue considérablement la charge mécanique et entraîne également des changements drastiques dans la dynamique des fluides, y compris les forces hydrostatiques. Cependant, on ne sait toujours pas quelles molécules de signalisation et quel(s) comportement(s) provoquent ces adaptations physiopathologiques.

L'exercice aquatique est l'un des meilleurs moyens d'atteindre une force corporelle optimale et d'améliorer la vigueur. Un tel exercice implique l'application physique de la dynamique des fluides, en particulier les forces hydrostatiques et la résistance à la traînée accompagnant la viscosité du liquide, et est efficace non seulement chez les individus en bonne santé, mais également chez les patients alités. Bien que de nombreuses études récentes aient évalué les paramètres dynamiques de l'écoulement en tant que stimuli physiques, les mécanismes de perception de ces stimuli et la transduction du signal de ces stimuli vers la formation des os et des muscles squelettiques, l'amélioration du physique et de la force restent flous.

Caenorhabditis elegans est un nématode vivant en liberté qui est également un animal de laboratoire largement utilisé. La longueur du corps peut être modifiée via une voie de signalisation du facteur de transcription transformant-β (TGF-β)/DBL-1 Smad hautement conservée.11–16 C. elegans a au moins deux allures locomotrices différentes, l'une est affichée en nageant dans un liquide et l'autre en rampant sur une surface.17–21 1 C. elegans s'adapte également à court terme à la locomotion en réponse à des stimuli mécaniques doux par le biais d'un complexe mécanosensoriel composé des canaux ioniques de la dégénérine, MEC-4 et MEC-10, présents dans les neurones sensibles au toucher.22–25 Les vers produisent également des réponses adaptatives à long terme. Par exemple, nous avons constaté de manière reproductible que les vols spatiaux induisaient une expression réduite de certains gènes musculaires,26–29, notamment des filaments musculaires épais, d'autres éléments du cytosquelette et des enzymes métaboliques mitochondriales. Ces changements d'expression génique semblaient être cohérents avec les changements de longueur corporelle et d'accumulation de graisse pendant les vols spatiaux.29

Cette étude a examiné l'altération de l'expression du gène de la myosine musculaire et du TGF-β en réponse aux propriétés dynamiques des fluides (microgravité, viscosité/résistance à la traînée et profondeur de la culture liquide). Nous avons également comparé la relation entre le physique du corps établi et les différents comportements de déplacement affichés par les vers cultivés dans un liquide et sur une surface de gélose humide, nageant et rampant, respectivement. Enfin, nous avons exploré l'hypothèse selon laquelle la signalisation neuromusculaire via TGF-β/DBL-1 module le physique altéré en réponse aux propriétés dynamiques des fluides.

Dans notre expérience spatiale d'interférence d'ARN de C. elegans (CERISE), des animaux au stade de larves L1 ont été cultivés de manière synchrone jusqu'à l'âge adulte dans un milieu liquide pendant 4 jours, soit en microgravité, soit dans une centrifugeuse 1G à bord du module d'expérience japonais de la Station spatiale internationale.30,31 2009, congelés 4 jours plus tard, et les échantillons congelés post-culture ont été renvoyés par la navette spatiale Endeavour, STS-130, le 21 février 2010. Les analyses d'expression par puce à ADN indiquent que les niveaux de filaments épais musculaires, d'éléments cytosquelettiques et d'enzymes métaboliques mitochondriales ont diminué par rapport aux cultures parallèles sur la centrifugeuse 1G (intervalle de confiance à 95 % (P⩽0,05) : numéro d'accession GSE71770 sur GEO).29 , les longueurs corporelles des vers cultivés en microgravité étaient légèrement (~ 5,5 %) mais significativement réduites par rapport aux vers cultivés dans la centrifugeuse embarquée 1G.29 Dans cette étude, nous avons confirmé que l'expression des gènes de la chaîne lourde de myosine, myo-3 et TGF-β, dbl-1 était réduite, respectivement de 60 % et 70 %, en microgravité par rapport à la centrifugeuse (Figure 1a). Ces observations suggèrent que la réduction de la longueur corporelle pourrait être due à des adaptations physiopathologiques à la microgravité causées par la répression transcriptionnelle des gènes musculaires et/ou une diminution de la signalisation du TGF-β, qui est causée par une diminution de l'expression de dbl-1.

La restauration de 1G sur la Station spatiale internationale augmente l'expression des gènes myo-3 et dbl-1 tout comme l'augmentation de la viscosité du liquide et de la profondeur de culture dans les expériences au sol. Les niveaux d'expression des gènes myo-3 et dbl-1 ont été surveillés chez des animaux de type sauvage en culture liquide et transportés dans l'espace (adulte de 4 jours) avec ou sans accélération 1G au cours de l'expérience spatiale ARNi de C. elegans (CERISE) dans le module d'expérience japonais KIBO30,31 (a). Des animaux de type sauvage ont été cultivés à partir du stade larvaire L1 pendant 4 jours dans différentes viscosités liquides avec 1,0 % (36,1 cSt) et 1,5 % (123,3 cSt) de méthylcellulose (b). Les animaux de type sauvage ont été cultivés à partir du stade larvaire L1 pendant 4 jours sur de la gélose au milieu de croissance des nématodes OP50 (NGM) immergée dans la profondeur indiquée du milieu liquide OP50 NGM (c). Les altérations de l'expression des gènes dbl-1 et myo-3 ont été surveillées par PCR quantitative en temps réel.

Dans des expériences au sol, afin d'étudier l'effet d'un paramètre de dynamique des fluides, la résistance à la traînée, sur l'expression des gènes myo-3 et dbl-1, des vers de type sauvage ont été cultivés pendant 4 jours après le stade larvaire L1 sous différentes viscosités liquides (1,0 cSt (0% méthylcellulose), 36,1 cSt (1,0% méthylcellulose) et 123,3 cSt (1,5% méthylcellulose)). L'expression du gène myo-3 a été significativement augmentée à une viscosité de 36,1 cSt et modérément augmentée à 123,3 cSt. L'expression du gène dbl-1 a augmenté de manière significative et modeste d'environ 20 % à 123,3 cSt (Figure 1b). Le taux de croissance et les moments de développement n'ont pas été significativement modifiés par la viscosité, toutes les larves L1 s'étant développées en hermaphrodites adultes gravides et matures à 4 jours. Chez les adultes gravides, la longueur du corps n'a pas augmenté autant que prévu pour les animaux élevés dans de la méthylcellulose à 1,5 %, suggérant peut-être que des concentrations plus élevées de méthylcellulose déshydratent les vers et/ou inhibent la digestion et l'absorption.

Pour étudier les effets de la modification de la profondeur de la culture liquide, la gélose au milieu de croissance des nématodes OP50 (NGM) a été recouverte d'un milieu liquide OP50 NGM supplémentaire (0, 6, 1, 2 ou 1, 8 mm de profondeur). Dans l'état le moins profond, les vers étaient complètement recouverts de liquide et le comportement de déplacement s'est transformé en nage. Chez les adultes gravides (jour 4), l'expression des gènes myo-3 et dbl-1 a augmenté avec l'augmentation de la profondeur de la culture liquide (figure 1c), l'expression maximale observée étant atteinte à 1, 2 mm. Les longueurs corporelles des vers cultivés dans différentes profondeurs de liquide étaient légèrement mais pas significativement plus grandes (0,6 mm : 1,35 ± 0,06 mm, 1,2 mm : 1,36 ± 0,07 mm, 1,8 mm : 1,37 ± 0,04 mm, n = 21 vers par groupe, P> 0,1). Ces résultats démontrent que le nématode C. elegans peut altérer l'expression des gènes musculaires et TGF-β en réponse aux paramètres dynamiques du flux. Cependant, les données d'expression génique et de longueur corporelle pour les vers cultivés à différentes profondeurs suggèrent que la réponse à la profondeur de culture est soit saturée une fois que les vers sont complètement submergés, soit une réponse tout ou rien.

Bien que la modification des paramètres dynamiques du flux ait augmenté l'expression de myo-3 et dbl-1 (figure 1), l'ampleur des changements significatifs en réponse à la culture en liquide sur le sol était faible. Afin d'explorer plus avant si et comment C. elegans modifie l'expression des gènes et le physique du corps en réponse à différents stimuli environnementaux et comportements en mouvement, nous avons mesuré les niveaux d'expression des gènes et la longueur du corps des vers de type sauvage cultivés soit dans un milieu liquide à profondeur fixe, soit sur une surface de gélose humide comme décrit dans Méthodes. La culture a eu lieu en parallèle avec des larves L1 écloses sur des plaques de gélose puis cultivées en liquide ou sur gélose. Le taux de croissance et les moments de développement n'étaient pas significativement différents entre les conditions de culture, toutes les larves s'étant développées en jeunes hermaphrodites adultes 3 jours après le début de la culture, comme en témoigne le début de la production d'œufs. Cependant, la longueur du corps au jour 4 (stade adulte gravide) était significativement plus longue pour les animaux cultivés en milieu liquide par rapport à la gélose humide (Figure 2a, b); cette différence a persisté aux derniers moments (5 et 6 jours; Figure 2c). Les niveaux d'expression d'un gène de la chaîne lourde de la myosine, myo-3, et de son facteur de transcription en amont, hlh-1, étaient également significativement plus élevés chez les animaux cultivés en liquide par rapport à l'agar (Figure 2d, e). De même, les niveaux d'expression de la protéine myosine ont été augmentés de 1,6 fois pour les animaux cultivés dans un liquide par rapport à de la gélose (1,24 fois dans un liquide et 0,78 fois sur de la gélose par rapport au rapport relatif d'une protéine ribosomale).

Altérations de la longueur corporelle et des niveaux d'expression génique de myo-3 et hlh-1 chez C. elegans cultivés dans différentes conditions de culture. Hermaphrodite adulte gravide de type sauvage cultivé sur plaque de gélose humide (a, indiqué en rose) ou en culture liquide (b, indiqué en bleu), pendant 4 jours à partir du stade larvaire L1. ( c ) Les longueurs corporelles ont été significativement augmentées par la culture liquide par rapport à la culture sur gélose. Les altérations des niveaux d'expression des gènes myo-3 (d) et hlh-1 (e) ont été surveillées par PCR quantitative en temps réel. Les points de données et les barres d'erreur indiquent les moyens ± sd (n = 60 vers par point de temps, ** P ≤ 0,01).

DBL-1 fait partie de la famille des protéines TGF-β. Il, avec sa voie de signalisation, est un régulateur connu de la longueur du corps de C. elegans.11–16 Pour déterminer si DBL-1 était nécessaire pour l'altération observée de la longueur du corps, nous avons mesuré la longueur des mutants dbl-1(wk70) et (nk3) après culture en liquide ou sur gélose. Nous avons également mesuré les mutants sma-4 (e729), car SMA-4 est un composant connu du facteur de transcription en aval de la cascade de signalisation DBL-1 qui contrôle la taille du corps. Contrairement au type sauvage (figures 2 et 3), les longueurs corporelles de ces mutants n'ont pas augmenté dans la culture liquide (figure 3), ce qui implique que dbl-1 et sma-4 sont nécessaires pour la modification de la longueur corporelle en réponse à la culture liquide.

DBL-1 et sa voie de signalisation sont nécessaires pour les altérations de la longueur du corps de C. elegans en réponse aux conditions de culture liquide. dbl-1(wk70) hermaphrodite adulte gravide cultivé sur plaques de gélose humide (a) ou en culture liquide (b) pendant 4 jours, à partir du stade larvaire L1. ( c ) Les longueurs corporelles de type sauvage, dbl-1 (wk70), dbl-1 (nk3) et sma-4 (e729) cultivées dans un liquide ou sur de la gélose pendant 4 jours ont été mesurées. Les barres et les barres d'erreur indiquent les moyens et sd (n = 30 vers par condition ; ** P ≤ 0,01).

Parce que des travaux antérieurs ont rapporté que DBL-1 contrôle l'expression de plusieurs gènes, y compris ceux codant pour les collagènes associés à la matrice extracellulaire, nous avons ensuite étudié si la culture liquide supprime les phénotypes dumpy et roller chez les mutants de collagène. Les longueurs corporelles des mutants dumpy dpy-5 (e907) et rol-6 (su1006) ont été nettement augmentées dans la culture liquide par rapport à la culture sur gélose (Figure 4a – d). De plus, la fréquence du phénotype de rouleau droitier induit par le rol-6 (su1006) a été réduite par la culture liquide (figure 4b). Pris ensemble, les résultats affichés dans les figures 1, 2 et 3 suggèrent que la culture liquide modifie le physique de C. elegans via l'activation de la signalisation TGF-β/DBL-1 (figure 3), non seulement en termes d'expression de la myosine musculaire (figure 2), mais également en termes de dépôt de matrice/collagène extracellulaire (figure 4).

Les phénotypes dumpy et roller sont atténués par la culture liquide. dpy-5(e907) (a, b), et RW1596 rol-6 (su1006) et Pmyo-3::GFP::myo-3 (c, d), les animaux ont été cultivés sur gélose humide (a, c) ou en culture liquide (b, d) pendant 4 jours, à partir du stade larvaire L1. (e) Leurs longueurs corporelles ont été mesurées. ( f ) La fréquence du phénotype du rouleau droitier dans RW1596 a été comptée. Les barres et les barres d'erreur indiquent les moyens et sd (n = 30 vers par condition ; * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01).

Chez C. elegans, un canal ionique sodium dégénérine/épithélial composé de MEC-4 et MEC-10 fonctionne comme un mécanocapteur pour les stimuli physiques (par exemple, le toucher). c-8(e15)). Alors que mec-4(e1611) et mec-10(e1515) ont affiché une augmentation de la longueur du corps en réponse à la culture liquide, unc-8(e15) n'a montré aucune augmentation significative de la longueur du corps (figure 5).

La dégénérine UNC-8 est nécessaire pour les modifications de la longueur du corps de C. elegans. mec-4(e1611), mec-10(e1515) et unc-8(e15) ont été cultivés pendant 4 jours en culture liquide ou gélosée, à partir du stade larvaire L1. Les longueurs du corps ont été mesurées. Les barres et les barres d'erreur indiquent les moyens et sd (n = 30 vers par condition ; ** P ≤ 0,01).

La transition de C. elegans entre les allures distinctes de rampement et de nage est contrôlée par les amines biogènes, la dopamine et la sérotonine.21 Par conséquent, nous avons mesuré les altérations de la longueur corporelle chez des animaux présentant des mutations dans les gènes codant pour l'enzyme biosynthétique de la sérotonine, tph-1(mg280), un membre de la famille des récepteurs de la sérotonine/octopamine, ser-5(ok3087), et les récepteurs de la dopamine de type D1, dop. -1(vs101) et dop-4(tm1329). dop-4 (tm1329) n'a montré aucune altération dépendante de la culture de la longueur du corps (figure 6), ce qui suggère que DOP-4 est également nécessaire pour l'altération physique. En revanche, les longueurs corporelles ont augmenté de manière significative dans la culture liquide par rapport à la culture sur gélose pour tph-1 (mg280), ser-5 (ok3087) et dop-1 (vs101) (Figure 6). Nous avons ensuite étudié l'impact d'autres facteurs sur la longueur du corps dans le système de culture liquide, en commençant par la détection d'oxygène et de nutriments. Pour ce faire, nous avons utilisé des animaux présentant des mutations dans les gènes codant pour le facteur de réponse à l'hypoxie, hif-1(ia4), un peptide analogue à l'insuline/IGF-1, ins-7(ok1573) et un régulateur transcriptionnel clé qui agit en aval de la signalisation médiée par l'insuline/IGF-1, daf-16(mu86). Dans tous les cas, la longueur du corps a augmenté en réponse à la culture liquide chez ces mutants (Figure 6). Un mutant du récepteur de la ryanodine unc-68(r1161)32, qui est lent et flasque, a également affiché une augmentation de la longueur du corps en culture liquide (Figure 6). Ces résultats suggèrent que l'altération du physique de C. elegans en réponse à la culture liquide nécessite une certaine signalisation neuromusculaire, mais est largement distincte de la détection de l'oxygène et des nutriments.

Plusieurs mutants de C. elegans montrent des augmentations de la longueur du corps de type sauvage dans la culture liquide par rapport à la culture sur gélose. De tous les mutants testés, seul dop-4 (tm1329) n'a pas réussi à augmenter sa longueur corporelle après 4 jours en culture liquide (n = 30 vers par condition ; ** P ≤ 0, 01).

Enfin, nous avons évalué si les taux de contraction accrus observés chez les vers nageurs étaient impliqués dans l'amélioration de la longueur du corps. Le cycle de flexion dorsale et ventrale (DV) de la tête a été compté chez différents mutants (tableau 1) : signalisation TGF-β (dbl-1 et sma-4) ; un canal dégénéré (unc-8) ; un récepteur de la dopamine de type D1 (dop-4); et un récepteur de la ryanodine (unc-68). unc-8 (e15) souvent anormalement enroulé et n'a pas modifié le cycle DV dans le liquide ou sur la plaque de gélose, cela correspondait au mutant ne présentant pas l'augmentation normale du cycle lors de la natation (tableau 1). En revanche, d'autres mutants de la dégénérine, mec-4 et mec-10, n'étaient pas significativement différents du type sauvage en termes de mouvement ou d'augmentation du cycle en réponse au mouvement de nage (mec-4 (e1611) : 0,53 ± 0,15 Hz sur gélose et 1,56 ± 0,19 Hz en liquide ; mec-10 (e1515) : 0,53 ± 0,19 et 1,53 ± 0,13 Hz, P > 0,1). Ces observations suggèrent que les mutants qui ne présentent pas d'augmentation de la longueur du corps (par exemple, unc-8) ne présentent pas non plus d'augmentation du cycle DV lors de la natation. Cependant, les mutants de signalisation du TGF-β (dbl-1 et sma-4) et du récepteur de la dopamine de type D1 (dop-4), qui n'ont pas non plus présenté d'augmentation de la longueur du corps, ont en fait affiché et augmenté le cycle DV lors de la natation. Ainsi, bien que l'augmentation du cycle DV lors de la natation ne soit pas suffisante pour augmenter la longueur du corps (par exemple, dbl-1, dop-4 et sma-4), cela peut être nécessaire (par exemple, unc-8).

Pour évaluer davantage l'exigence de signalisation TGF-β, nous avons mesuré quantitativement l'expression génique de TGF-β, dbl-1 et son signal en aval, wrt-4.33 Comme le montre le tableau 1, unc-8 (e15) et dop-4 (tm1392), dont la longueur du corps n'a pas augmenté en réponse à la culture liquide (figures 5 et 6), n'ont pas présenté d'induction de dbl-1 ou wrt-4. Ces résultats suggèrent que l'unc-8 et la dop-4 agissent en amont de dbl-1 pour contrôler la réponse à la culture en liquide. Conformément à cela, dbl-1 et sma-4 ont affiché une induction de dbl-1, vraisemblablement car les capteurs en amont sont intacts dans ces mutants, mais n'ont pas affiché d'induction de wrt-4, confirmant ainsi que la signalisation TGF-β est nécessaire pour l'induction de wrt-4 en réponse à la culture liquide. En revanche, unc-68 (r1161) a augmenté la longueur du corps et l'expression des gènes (tableau 1, figures 5 et 6). Ces résultats suggèrent que pour étendre la longueur du corps en culture liquide : (1) la signalisation TGF-β/DBL-1 est essentielle, mais (2) l'augmentation du cycle DV par le comportement de nage peut être nécessaire mais pas suffisante.

C. elegans est un nématode vivant librement présent dans le sol et la végétation en décomposition, et il persiste sur les particules à surfaces humides et dans des conditions aquatiques. C. elegans présente au moins deux allures locomotrices distinctes, nageant lorsqu'il est dans un liquide et rampant lorsqu'il est sur des surfaces.17–21 La tension superficielle est nécessaire pour retenir C. elegans sur des surfaces humides et devrait être de l'ordre de 10 000 × G.28,34,35 charges externes, et une puissance musculaire substantielle est utilisée pour contrer la charge externe et déplacer le corps. À l'appui de cette spéculation, une transition de marche continue entre des ondulations qui ressemblent à la nage ou au rampement a déjà été observée avec l'augmentation de la viscosité du liquide.20

Ces observations, cependant, n'expliquent pas entièrement pourquoi le physique de C. elegans est significativement modifié dans le liquide par rapport à la gélose. La transition de la marche, par nécessité, doit être une réponse adaptative à court terme, alors que la modification du physique est généralement une réponse adaptative à long terme.

Ramper et nager sont des comportements assez différents. C. elegans rampant sur de la gélose humide présente des courbures dorso-ventrales en forme de S avec une amplitude moyenne de 135° à une fréquence de 0,5–0,8 Hz.18,21 En revanche, C. elegans nageant présente des courbures dorso-ventrales en forme de C avec une amplitude moyenne de 45° à une fréquence de 1,7–2,1 Hz.18,21 De plus, C. elegans nage en continu pendant de longues périodes, 45 min de plus.21 Ces comportements quantitativement distincts en termes de fréquence, d'amplitude et de propagation des courbures dorso-ventrales peuvent susciter des réponses adaptatives distinctes à long terme qui modifient l'expression des gènes pour façonner un physique le plus adapté à l'environnement.

Lorsqu'il est cultivé dans un liquide, la longueur du corps et les niveaux d'expression du gène myo-3 de la chaîne lourde de la myosine et de son activateur transcriptionnel, hlh-1 (MyoD) ont augmenté par rapport à la culture sur gélose. Celles-ci semblent être une réponse adaptative à long terme à la croissance dans l'environnement liquide. Une voie de signalisation clé déjà connue pour moduler la longueur du corps de C. elegans, la voie de signalisation TGF-β/DBL-1,11–16 était à la fois nécessaire pour l'altération physique en réponse à la culture liquide et induite par la transcription en réponse à la culture liquide. L'induction de l'expression de dbl-1 en réponse à la culture liquide semble avoir été due à la dynamique des fluides, car l'expression de dbl-1 a été induite à la fois par l'augmentation de la viscosité et de la profondeur de la culture liquide (Figure 1). Curieusement, l'expression de dbl-1 a été induite par culture liquide sur une centrifugeuse 1G à bord de la Station spatiale internationale par rapport à la microgravité spatiale (Figure 1). Il est possible que l'augmentation de la pression hydrostatique sur les vers cultivés avec une accélération 1G dans l'espace ait eu un impact sur l'expression de dbl-1. Comme nous n'avons pas mesuré la pression hydrostatique, de futures expériences examinant l'altération de l'expression de dbl-1 en réponse à la pression hydrostatique sont nécessaires.

Chez C. elegans, les membres de la famille des canaux dégénérine/épithélial Na+ agissent comme des mécanocapteurs pour divers stimuli physiques. Ainsi, nous étions curieux de savoir s'ils pouvaient détecter la dynamique des fluides et éventuellement effectuer l'expression de dbl-1. MEC-4 et MEC-10 forment un hétérocomplexe de sous-unités formant des pores ioniques dans les neurones sensibles au toucher22-24 et ce complexe est essentiel pour la réponse à l'hypergravité.25 Cependant, notre découverte selon laquelle la taille du corps augmente en culture liquide même en l'absence de l'hétérocomplexe MEC-4/10 suggère que ce complexe n'est pas nécessaire pour modifier le physique en réponse à la dynamique des fluides. Au lieu de cela, nous avons constaté que d'autres membres de la famille des canaux Na+ dégénérés/épithéliaux, en particulier l'UNC-8, sont nécessaires pour modifier le physique en réponse à la dynamique des fluides (Figure 1). Cela suggère qu'ils peuvent agir comme des mécanorécepteurs sensibles aux fluides. UNC-8 est exprimé dans les neurones moteurs de la moelle ventrale.36–38 De plus, le TGF-β/DBL-1, qui régule en fonction de la dose la taille corporelle de C. elegans, est principalement exprimé dans les motoneurones et l'anneau nerveux ; le site connu d'expression de dbl-1 correspond étroitement au site connu d'action de l'UNC-8. Par conséquent, le complexe de dégénérine UNC-8 pourrait détecter des stimuli physiques provenant des conditions de culture et/ou des altérations de la posture corporelle et/ou de la tension générées par des démarches variables, conduisant à la régulation à la hausse de DBL-1. Le ligand DBL-1 régulé à la hausse agit ensuite, via des mécanismes connus, sur les cellules musculaires et hypodermiques pour contrôler le physique du corps en facilitant l'expression de la myosine musculaire et du collagène de la cuticule.

Comme autre possibilité, le comportement de nage pourrait être nécessaire pour modifier le physique du corps car les mutants unc-8 (e15) perdent complètement les comportements de déplacement normaux à la fois dans le liquide et sur une surface de gélose (tableau 1). Enfin, comme la dynamique des fluides, en particulier les forces hydrostatiques et la résistance à la traînée accompagnant la viscosité du liquide, améliorent la formation des os et des muscles squelettiques chez les personnes moins actives,5-10 nous étions curieux de savoir si cela était également vrai pour les vers moins actifs. En effet, un mutant lent et flasque, unc-68, a affiché une augmentation de la longueur du corps en réponse à la culture liquide (Figure 6). Cela suggère non seulement qu'un effet de dynamique des fluides indépendant de l'activité, éventuellement la facilité de mobilité facilitée par la flottabilité, semble être conservé au cours de l'évolution entre C. elegans et l'homme, mais aussi que C. elegans pourrait être un modèle approprié pour étudier et combattre l'impact de l'inactivité sur le muscle humain.

Des travaux récents ont élucidé que C. elegans emploie des amines biogènes (dopamine et sérotonine) pour contrôler la transition de la marche entre ramper et nager,21 une adaptation à court terme. La dopamine est nécessaire pour initier et maintenir le ramper sur terre après avoir nagé dans l'eau, et la sérotonine est nécessaire pour passer du ramper au comportement de nage. Nous étions curieux de savoir si cette adaptation à court terme avait également un rôle dans l'adaptation à long terme du physique. Alors que les mutations dans dop-1, ser-5 et tph-1 affichent une augmentation de la longueur du corps de type sauvage en réponse à la culture liquide, les mutants dop-4 n'affichent pas d'augmentation de la longueur. Cela suggère que DOP-4 est nécessaire non seulement pour l'adaptation à la marche à court terme, mais également pour l'adaptation physique à long terme à la culture liquide. Le DOP-4 est un récepteur de la dopamine de type D1 qui est connu pour être impliqué dans la désinhibition induite par l'alcool de certains comportements, y compris les postures de recherche de nourriture et de rampement dans l'eau.39 Ainsi, le DOP-4 peut fonctionner comme un élément clé de l'adaptation de C. elegans aux environnements aquatiques participant aux réponses adaptatives à court et à long terme.

C. elegans poussant dans un liquide, comme à l'état sauvage, peut être sujet à l'hypoxie et à une nutrition limitée. Nous avons donc cherché à savoir si ces facteurs pouvaient contribuer à l'augmentation de la longueur du corps en culture liquide. Cependant, les mutations de hif-1, ins-7 et daf-16 ont toutes répondu comme un type sauvage, suggérant que ni la détection d'oxygène ni la détection de nutrition ne contribuaient à l'augmentation de la longueur du corps. Cela peut ne pas être surprenant étant donné que UNC-8 et/ou DOP-4 semblent détecter la dynamique des fluides et que le type sauvage et tous les autres mutants testés se sont développés au même rythme dans une culture liquide ou gélosée.

En conclusion, nos résultats suggèrent que l'UNC-8 et/ou le DOP-4 peuvent fonctionner comme des capteurs/transmetteurs neuronaux des propriétés dynamiques des fluides, y compris la viscosité/résistance à la traînée et éventuellement la pression hydrostatique. Il semble que l'activation de ces capteurs/transmetteurs neuronaux par les propriétés dynamiques des fluides augmente l'expression de dbl-1 pour augmenter la signalisation de DBL-1, provoquant une augmentation de la taille corporelle et de l'expression des protéines musculaires.

La souche C. elegans N2 Bristol a été utilisée comme type sauvage. Les souches mutantes étaient les suivantes : Dérivé BC15777 : dpy-5(e907) ; RW1596 : myo-3(st386), stEx30 [myo-3p::GFP+rol-6(su1006)] ; LT121 : dbl-1 (semaine 70) ; NU3 : dbl-1(nk3) ; DR1369 : sma-4(e729) ; CB1611 : mec-4(e1611) ; CB1515 : mec-10(e1515) ; CB15 : unc-8(e15) ; ZG31 : hif-1(ia4); CF1038 : daf-16(mu86); RB1388 : ins-7 (ok1573) ; GR1321 : tph-1(mg280) ; RB2277 : ser-5 (ok3087) ; LX636 : dop-1 (vs101) ; FG58 : dop-4 (tm1392) ; et TR2170 : unc-68(r1161). Ces souches ont été obtenues auprès du Caenorhabditis Genetics Center (Université du Minnesota, Minneapolis, MN, USA).

Trente à cinquante hermaphrodites adultes de type sauvage ou mutant ont été transférés sur une plaque de gélose de milieu de croissance de nématodes (NGM) fraîchement préparée (boîte de culture en plastique de ϕ6 cm) avec la souche Escherichia coli OP50 répartie sur la surface comme source de nourriture. Les adultes ont été autorisés à pondre des œufs pendant 4 heures à 20 °C ; cela a donné au moins 500 œufs sur chaque assiette. Les adultes et la source de nourriture bactérienne ont été lavés de la plaque par pipetage doux avec 2 ml de tampon M9 trois fois. Les œufs restants ont été laissés pendant 12 h supplémentaires à 20 ° C, moment auquel les larves L1 écloses ont été recueillies dans 500 ul de tampon M9. Soixante larves L1 par condition ont été simultanément cultivées à 20 ° C sur une plaque de gélose OP50 NGM ou dans un système de culture NGM liquide de 2 ml contenant E. coli OP50 (OD600 = 1, 0; profondeur de liquide = 0, 8 mm) dans une boîte de culture en plastique de ϕ6 cm. Trois jours après la culture, le type sauvage et tous les autres mutants testés dans cette étude avaient atteint l'âge adulte, comme en témoigne le début de la production d'œufs ; ceci a été observé dans les deux conditions de culture. Pour éviter la famine, les animaux adultes ont été prélevés à l'aide d'un fil de platine de ϕ0,2 mm et transférés dans un nouveau milieu chaque jour ; des transferts ont eu lieu pour les deux conditions de culture.

Pour étudier les effets de la viscosité liquide sur l'expression génique (voir ci-dessous), des concentrations finales de 1,0 et 1,5% de méthylcellulose dans 2,0 ml de milieu liquide NGM contenant E. coli OP50 (OD600 = 1,0) ont été utilisées. Les viscosités cinétiques, mesurées par un viscosimètre Visoboy2 (LAUDA, Allemagne), étaient de 1,0 cSt (mm2/s) pour le liquide témoin OP50 NGM, de 36,1 cSt pour la méthylcellulose à 1,0 % et de 123,3 cSt pour la méthylcellulose à 1,5 %.

Pour étudier les effets de la profondeur de la culture liquide, de la gélose OP50 NGM dans des plaques de ϕ6 cm a été en outre recouverte de 1,5 ml (~ 0,6 mm de profondeur), 3,0 ml (~ 1,2 mm de profondeur) ou 4,5 ml (~ 1,8 mm de profondeur) de milieu liquide NGM contenant E. coli OP50 (OD600 = 1,0). De L1 à l'âge adulte, tous les animaux sont entièrement couverts et ont montré un comportement de nage même dans les conditions les moins profondes.

La longueur du corps de C. elegans a été évaluée au jeune âge adulte (3 jours après le début en tant que larve L1) et les 3 jours suivants. Chaque jour, un sous-ensemble d'animaux de culture a été fixé avec du paraformaldéhyde à 1 % pendant 30 min à température ambiante et a été imagé à l'aide d'un microscope BX51 et d'une caméra DP71 (Olympus Optical, Tokyo, Japon). Les longueurs corporelles ont été mesurées à l'aide du logiciel d'analyse d'images CellSens (Olympus). Chaque expérience a été réalisée en triple avec trois échantillons indépendants (total n = 60 vers par point de temps). L'analyse statistique a été effectuée dans MS Excel (Microsoft Co., Redmond, WA, USA). La signification statistique a été fixée à P<0,05, en utilisant un test t bilatéral de Student.

Chaque essai a été effectué sur 10 vers adultes jamais affamés à 4 jours à partir de larves L1 cultivées dans un liquide ou sur une plaque de gélose humide. Le cycle de flexion de la tête DV a été compté pendant 30 s sous stéréomicroscopie en tant que taux de contraction de la nage ou du rampement, juste après avoir tapoté chaque plaque de culture.

L'ARN total a été isolé le jour de culture indiqué à partir d'environ 300 hermaphrodites adultes à l'aide de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Une analyse PCR quantitative en temps réel a été réalisée avec un système de PCR en temps réel CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) et un kit SYBER ExScript RT-PCR (TaKaRa Bio, Shiga, Japon). Le niveau d'expression du facteur d'élongation eef-2 a été utilisé comme étalon interne et le rapport relatif de l'expression génique pour chaque gène a été calculé comme décrit.40 Les ensembles d'amorces suivants ont été utilisés pour amplifier eef-2, hlh-1, myo-3, dbl-1 et wrt-4 : TTC CTG TGA CCT GAG ACT CC-3′ ; hlh-1 (aller) 5′-GCT CGG GAA CGC GGT CGA-3′ et (arrière) 5′-GGA ATG CTC GCA ACG ATC CGC GA-3′ ; myo-3 (avant) 5′-ACT CTC GAA GCC GAA ACC AAG-3′ et (inverse) 5′-TGG CAT GGT CCA AAG CAA TC-3′ ; dbl-1 (aller) 5′-CAG TTT GGC TTC GAT TGC TC-3′ et (inverse) 5′-TGA AGC TGG TCC TCT GTC TG-3′ ; et wrt-4 (avant) 5′-TGG ATG AGC TCG CAG TGG-3′ et (arrière) 5′-CTC CGT TGT CAA GTG TGA ATT CTA C-3′. Des expériences de PCR en temps réel ont été réalisées en triple pour chaque échantillon biologique.

Nous avons également mesuré les niveaux d'expression de certains gènes chez des adultes de 4 jours de type sauvage transportés dans l'espace à partir du CERISE.30,31

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Nous remercions l'ensemble de l'équipage du CERISE pour leur travail sur STS-129, STS-130 et la Station Spatiale Internationale. Le CERISE a été organisé avec le soutien de la JAXA. Nous remercions également le Caenorhabditis elegans Genetic Center pour avoir aimablement fourni les souches mutantes. Ce travail a également été soutenu par les numéros de subvention JSPS KAKENHI 26506029, 15H05937, le programme interministériel de promotion de l'innovation stratégique (J150000592), le Medical Research Council UK (G0801271) et les National Institutes of Health (NIH NIAMS ARO54342). Ce travail a été soutenu par des subventions du MEXT, du JSPS (15H05937, 26506029), du programme interministériel de promotion de l'innovation stratégique (J150000592) et du projet d'expérimentation de biologie cellulaire mené par l'Institut des sciences spatiales et astronautiques de JAXA. TE a été soutenu par le Medical Research Council du Royaume-Uni (G0801271). Le NJS a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH NIAMS ARO54342).

Shunsuke Harada

Adresse actuelle : 9 Adresse actuelle : École de médecine, Université de Kobe, Kobe, Japon.,

Shunsuke Harada et Toko Hashizume : Ces auteurs ont contribué à parts égales à ce travail.

Département des sciences de la vie environnementale, École supérieure des sciences de la vie, Université de Tohoku, Sendai, Japon

Shunsuke Harada, Kanako Nemoto, Zhenhua Shao, Nahoko Higashitani & Atsushi Higashitani

Services d'ingénierie avancée, Tsukuba, Japon

Toko Hashizume

Département coopératif de médecine environnementale spatiale, École supérieure des sciences médicales et dentaires, Université de Kagoshima, Kagoshima, Japon

Toko Hashizume et Akira Higashibata

Département des sciences du sport et de la santé, Collège des sciences de la vie et de l'environnement, Université d'Exeter, Exeter, Royaume-Uni

Timothée Etheridge

MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Aging Research and National Centre for Sport and Exercise Medicine, Royal Derby Hospital, University of Nottingham, Derby, Royaume-Uni

Nathaniel J. Szewczyk

Forum spatial japonais, Chiyoda-ku, Japon

Keiji Fukui

Direction de la technologie des vols spatiaux habités, Agence japonaise d'exploration aérospatiale, Tsukuba, Japon

Akira Higashibata

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Recherche conçue par AtsH. SH, TH, KN, ZS, NH et AkH ont effectué des analyses d'expression génique et des observations microscopiques. KF et AkH ont coordonné l'expérience en vol CERISE. SH, AkH, TH, KN, TE, NJS et AtsH ont analysé les données et rédigé l'article.

Correspondance à Atsushi Higashitani.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/

Réimpressions et autorisations

Harada, S., Hashizume, T., Nemoto, K. et al. La dynamique des fluides modifie la longueur du corps de Caenorhabditis elegans via la signalisation neuromusculaire TGF-β/DBL-1. npj Microgravité 2, 16006 (2016). https://doi.org/10.1038/npjmgrav.2016.6

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Reçu : 30 avril 2015

Révisé : 14 décembre 2015

Accepté : 10 janvier 2016

Publié: 07 avril 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/npjmgrav.2016.6

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